該模型采用了CRISPR/Cas9技術(shù)，創(chuàng)新性地結(jié)合了人類遺傳學(xué)與動物基因編輯技術(shù)，首次在小鼠上重構(gòu)了與人類疾病類似的遺傳模式，在Tbx6基因上同時引入無效突變和promotor區(qū)域的亞效等位基因，并將二者結(jié)合，形成復(fù)合雜合突變并獲得相應(yīng)的脊柱畸形表型。該模型是國際上首創(chuàng)的復(fù)合雜合突變脊柱畸形表型，對于解釋先天性脊柱側(cè)凸的分子機(jī)制和發(fā)病過程具有極高的研究討論價值。

該基因編輯小鼠將在屏障隔離環(huán)境（北京協(xié)和醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心）內(nèi)進(jìn)行繁育、飼養(yǎng)及相關(guān)實(shí)驗(yàn)，其監(jiān)督管理措施由動物中心負(fù)責(zé)。屏障隔離期間將保持清潔，保證其具有SPF級別清潔度，減少感染及發(fā)病幾率。嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)室管理，防止小鼠外泄，實(shí)驗(yàn)設(shè)計時將禁止其與野生型小鼠交配，保證編輯基因組序列不向自然界流通。上述措施將保證該動物模型的生物安全性，避免其影響生態(tài)環(huán)境。

1. 劑量依賴性的先天性椎體畸形復(fù)合遺傳模型

使用小鼠胚胎的體內(nèi)測定，我們展示了劑量依賴性的先天性椎體畸形復(fù)合遺傳模型。該模型由Tbx6無效等位基因 (?) 和亞等位基因（mh）組成。(A) 阿爾新藍(lán)染色的E14.5小鼠胚胎的背面視圖。顯示了一個沒有明顯椎體畸形的胚胎。(B) 顯示了一個具有椎體畸形的胚胎。紅點(diǎn)和箭頭分別表示椎體畸形和肋骨融合。比例尺為1mm。 (C) 在Tbx6 + / +，Tbx6 + / mh，Tbx6 mh / mh或Tbx6 + / ? 的E14.5小鼠胚胎中未觀察到明顯的椎體畸形，而Tbx6 mh / ? 胚胎表現(xiàn)出高穿透率的椎體畸形。樣本量顯示在下面的列中。****，P ＜0.0001。

2. 成年小鼠的Micro-CT結(jié)果

成年小鼠的Micro-CT結(jié)果。(A) 通過Micro-CT掃描顯示成年小鼠的背側(cè)和腹側(cè)圖像，未見明顯椎體畸形。(B) 通過Micro-CT掃描顯示一只具有椎體畸形的小鼠。 白色箭頭和箭頭分別指示椎體畸形和肋骨融合。(C) Tbx6 + / +，Tbx6 + / mh，Tbx6 mh / mh，Tbx6 + / + 和Tbx6 mh / ? 基因型的成年小鼠Micro-CT圖像。 樣本量顯示在每列下方。 ****，P ＜0.0001。

FVB/NJ品系基因敲除小鼠。

采用CRISPR-Cas9技術(shù)編輯小鼠基因組。表 1中顯示了小鼠基因組中指導(dǎo)RNA的靶標(biāo)。我們混合了向?qū)NA和Cas9mRNA（每個RNA 10 ng /μl），注射到FVB / NJ品系小鼠的合子（每次注射編輯200個細(xì)胞）。取得F0小鼠后，與野生型FVB / NJ小鼠雜交以獲得后代。我們使用來自腳趾的基因組DNA，通過PCR和Sanger測序?qū)π∈筮M(jìn)行基因分型。用于擴(kuò)增和測序的PCR引物在表 2中顯示。

表 1. 小鼠基因組中單向?qū)NA（sgRNA）的靶序列。

表 2. 小鼠Tbx6基因分型的引物。

先天性脊柱側(cè)凸即通過X線，MRI或手術(shù)證實(shí)的特定的先天性椎體異常而引起的脊柱側(cè)凸。這種畸形出生后即發(fā)病，因而患者出現(xiàn)畸形較特發(fā)性脊柱側(cè)凸早。早期發(fā)病使先天性脊柱側(cè)凸患者很少能接受到早期最佳的治療。由于形成的彎曲易于進(jìn)展，并且患者仍有較長的生長期，所以容易產(chǎn)生較嚴(yán)重的畸形。先天性脊柱側(cè)凸通常較僵硬，難于矯正。根據(jù)畸形的類型對脊柱側(cè)凸進(jìn)行分型，主要分為形成障礙，分節(jié)不良和混合畸形。形成障礙最典型的例子即半椎體；典型的分節(jié)不良為骨橋，即兩個或多個椎體一側(cè)或雙側(cè)的骨性連接；混合型即同一患者同時具有以上2種畸形。