給予動物鼠籠傾斜、潮濕墊料、高溫、噪音、束縛、電擊、游泳、晝夜節(jié)律顛倒等不同刺激因子，且刺激因子安排為多變性和不可預(yù)測，可誘導(dǎo)性是模型制造成功的關(guān)鍵。該模型被廣泛用于抑郁癥神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制及抗抑郁藥物的研究，以及伴發(fā)的焦慮、學(xué)習(xí)記憶障礙及防護(hù)藥物研究。

本研究中，通過水迷宮實(shí)驗(yàn)、避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看CUMS模型組水迷宮尋臺潛伏期顯著性延長，避暗錯誤次數(shù)顯著性增加、避暗潛伏期顯著性減少等，這些行為學(xué)結(jié)果，提示大小鼠CUMS模型成功。此外本實(shí)驗(yàn)還對CUMS模型的機(jī)制進(jìn)行了基礎(chǔ)研究，認(rèn)為CUMS模型會導(dǎo)致動物皮層的5-HT、DA、Ach、NE等神經(jīng)遞質(zhì)水平顯著性降低（P<0.05）。因此我們認(rèn)為采用慢性不可預(yù)測應(yīng)激，35天可以造成大鼠和小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。

模型技術(shù)難點(diǎn)在于對于CUMS刺激因子的選擇，刺激因子的選擇可能影響實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷某晒εc否，常用的刺激因子有禁食(12 h)、禁水(12 h)、冷水游泳(4 °C，5 min)、熱水游泳(42 °C，5 min)、動物叫聲(0.5 h)、束縛(使用自行研發(fā)的小鼠行為限制器，長20 cm，直徑7 cm)、晝夜顛倒、配對飼養(yǎng)、濕籠、傾籠等。每日選擇2~3 種刺激，并盡量使應(yīng)激程序符合不可預(yù)測的特點(diǎn)，以避免動物產(chǎn)生適應(yīng)性。相同的刺激因子應(yīng)該隔3-7日再進(jìn)行。

本研究通過不同的刺激因子對老鼠造成慢性不可預(yù)測應(yīng)激模型，通過水迷宮、避暗等經(jīng)典行為學(xué)指標(biāo)，以及5-HT、DA、Ach、NE等神經(jīng)遞質(zhì)基礎(chǔ)機(jī)制指標(biāo)，表明了慢性不可預(yù)測應(yīng)激誘導(dǎo)老鼠學(xué)習(xí)記憶損傷模型的成功，并且該模型對于大小鼠具有相同的效果，本模型可用于進(jìn)一步的改善學(xué)習(xí)記憶藥物的藥效學(xué)評價。

本實(shí)驗(yàn)采用健康成年SPF級老鼠。飼料墊料均為高壓滅菌產(chǎn)品，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物用水均經(jīng)過除菌處理。實(shí)驗(yàn)動物以完整的包裝直接進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，觀察適應(yīng)5天后無異常情況，方進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程中動物操作均符合動物倫理學(xué)規(guī)范，對環(huán)境和生態(tài)影響等符合國家相關(guān)法律規(guī)定。

1、注射AAV-Exon1-103Q-GFP的恒河猴腦部病理表型

亨廷頓蛋白免疫熒光染色：

為了觀察注射入紋狀體的HD患者腦提取物在動物腦內(nèi)的分布情況以及對神經(jīng)細(xì)胞的影響，在立體定位注射手術(shù)后30周，注射部位免疫熒光染色的結(jié)果如圖1 A-H所示，（A-D）注射AAV-Exon1-103Q-GFP的模型組動物，在MAP2陽性細(xì)胞的胞質(zhì)中有GFP和mHTT陽性聚集物的染色。（E-H）注射AAV-Exon1-19Q-GFP的對照組動物細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)彌漫性的GFP和mHTT陽性染色。（I）模型組和對照組紋狀體神經(jīng)元數(shù)量未觀察到明顯改變。（J）模型組紋狀體星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加。（K）與對照組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)外的mHTT聚集物數(shù)量更多。（L）對照組和模型組動物內(nèi)源性HTT蛋白水平無明顯差異。

立體定位注射手術(shù)后30周，免疫熒光染色檢測注射部位mHTT的分布情況（A-H）。注射部位神經(jīng)細(xì)胞密度和mHTT的分布水平（I-L）。

2、注射AAV-Exon1-103Q-GFP的恒河猴行為學(xué)表現(xiàn)

Viewpoint視頻監(jiān)測系統(tǒng)檢測動物運(yùn)動量

在腦立體定位注射HD患者腦提取物手術(shù)后，通過Viewpoint視頻系統(tǒng)對動物進(jìn)行運(yùn)動量檢測，結(jié)果如圖2所示，與對照組動物相比，（A）注射AAV-Exon1-103Q-GFP動物的總運(yùn)動距離無明顯差異，（B）動作劇烈程度的分布無顯著差異，靜止、中等強(qiáng)度和劇烈活動的比例無明顯差異。對照組和模型組動物的活動量無明顯差異。

取物試驗(yàn)（Object retrieval task）

在腦立體定位注射AAV-Exon1-103Q-GFP手術(shù)后，通過取物試驗(yàn)檢測模型組和對照組動物的運(yùn)動和認(rèn)知功能水平。結(jié)果如圖3所示，與對照組相比，（A）注射AAV-Exon1-103Q-GFP后，模型組動物在取物訓(xùn)練過程中出現(xiàn)的運(yùn)動錯誤數(shù)量無明顯差異，（B）模型組動物取物訓(xùn)練過程中出現(xiàn)的認(rèn)知錯誤無明顯差異，（C）各組動物一次嘗試即正確完成的成功率無明顯差異。結(jié)果反映，模型組與對照組在上肢運(yùn)動和認(rèn)知功能上無明顯差異。

構(gòu)建腺相關(guān)病毒（AAV2/6），表達(dá)具有103個CAG重復(fù)序列的mHTT，并帶有綠色熒光標(biāo)記。將過表達(dá)變異亨廷頓蛋白的腺相關(guān)病毒通過腦立體定位注射的方法注射到恒河猴（5-6周歲，體重5-7公斤）雙側(cè)紋狀體內(nèi)，從而建立亨廷頓病的恒河猴模型。每只動物注射AAV劑量為200μl，2.65×1013IU。

一、疾病名稱

亨廷頓病（Huntington’s disease，HD）

二、HD簡介

臨床癥狀主要表現(xiàn)為舞蹈樣不自主動作、精神障礙和進(jìn)行性癡呆，稱為“三聯(lián)征”。

病理表現(xiàn)主要為基底節(jié)區(qū)萎縮，其中以尾狀核最為明顯，殼核和蒼白球也有不同程度的萎縮。神經(jīng)元缺失主要見于基底節(jié)區(qū)和皮質(zhì)。

發(fā)病機(jī)制是一種常染色體顯性遺傳性神經(jīng)退行性疾病。患者第四號染色體上的Huntington基因發(fā)生變異，產(chǎn)生了變異的mHTT，在細(xì)胞內(nèi)逐漸聚集，形成大的分子團(tuán)，在腦中積聚，影響神經(jīng)細(xì)胞的功能。

三、亨廷頓蛋白與HD

huntington基因處在第4號染色體的上部，亨廷頓病是由于huntington基因第1外顯子內(nèi)部不穩(wěn)定的CAG三核苷酸重復(fù)序列異常擴(kuò)展而發(fā)病，屬于三聯(lián)體重復(fù)序列疾病。等位基因CAG的重復(fù)數(shù)在正常人多在26次以下，HD患者則多超過40.5次，平均46.42次，可高達(dá)100次。

huntington蛋白在全身各個器官包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)，其正常功能尚未完全明確，可能與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、細(xì)胞內(nèi)吞和分泌及抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。亨廷頓病患者h(yuǎn)untington基因的重復(fù)CAG序列可產(chǎn)生一段多聚谷氨酰胺鏈（polyglutamine，polyQ），連于HTT的末端，使HTT與其他蛋白結(jié)合形成不溶性復(fù)合物（核內(nèi)包涵體形成），并與其他蛋白相互作用，使神經(jīng)元內(nèi)蛋白錯誤折疊，影響蛋白的進(jìn)展和降解過程，產(chǎn)生毒性功能。